Bedankt voor uw bezoek aan nature.com.U gebruikt een browserversie met beperkte ondersteuning voor CSS.Voor de beste ervaring raden we u aan een meer up-to-date browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen).Om voortdurende ondersteuning te garanderen, geven we de site in de tussentijd weer zonder stijlen en JavaScript.Nature Communications volume 13, Artikelnummer: 2919 (2022 ) Citeer dit artikelGenetisch gecodeerde fluorescerende biosensoren zijn krachtige hulpmiddelen die worden gebruikt om chemische processen in intacte biologische systemen te volgen.De ontwikkeling en optimalisatie van biosensoren blijft echter een uitdagend en arbeidsintensief proces, voornamelijk als gevolg van technische beperkingen van methoden voor het screenen van kandidaat-biosensoren.Hier beschrijven we een screeningsmodaliteit die druppelmicrofluïdica en geautomatiseerde fluorescentiebeeldvorming combineert om een ​​orde van grootte toename van de screeningsdoorvoer te bieden.Bovendien, in tegenstelling tot de huidige technieken die beperkt zijn tot het screenen op een enkele biosensor-functie tegelijk (bijv. helderheid), maakt onze methode het bovendien mogelijk om meerdere functies (bijv. contrast, affiniteit, specificiteit) parallel te evalueren.Omdat biosensorfuncties kunnen variëren, is deze mogelijkheid essentieel voor snelle optimalisatie.We gebruiken dit systeem om een ​​krachtige biosensor voor lactaat te genereren die kan worden gebruikt om intracellulaire lactaatconcentraties te kwantificeren.Deze biosensor, genaamd LiLac, vormt een belangrijke vooruitgang in het meten van metabolieten en demonstreert de kracht van onze screeningaanpak.Genetisch gecodeerde fluorescerende biosensoren zijn belangrijke hulpmiddelen voor het bestuderen van het metabolisme.Hun fluorescentiesignaal biedt een hoge temporele resolutie, zowel op snelle tijdschalen als tijdens chronische beeldvorming1,2,3,4,5, en omdat ze genetisch gecodeerd zijn, kunnen ze direct tot expressie worden gebracht in levende cellen en gericht zijn op specifieke celtypen en organellen6,7 .Omdat afzonderlijke cellen metabolisch verschillend kunnen zijn en metabolieten in een hoog tempo worden omgezet8,9, hebben biosensoren op unieke wijze nauwkeurige metingen mogelijk gemaakt in individuele cellen van metabole toestanden en metabole verstoringen als reactie op een uitdaging of stimulus1,10.Om metabolietconcentraties te kwantificeren, moet de uitlezing van een fluorescerende biosensor worden i) afgestemd op fysiologische concentraties van het doelligand, ii) zeer specifiek voor dat ligand, en iii) robuust tegen veranderingen in de cellulaire omgeving (inclusief pH) en het expressieniveau van de biosensor zelf.De enige manier om dergelijke hoogwaardige biosensoren te ontwikkelen, is door ze te screenen, waarbij veel individuele varianten uit grote biosensorbibliotheken worden getest, omdat ze worden blootgesteld aan veel ligandconcentraties en -omstandigheden.Dit vormt een uitdaging voor de screening van biosensoren.Ondanks indrukwekkende vooruitgang in het ontwerpen van nieuwe platforms voor evoluerende fluorescerende eiwitten en biosensoren7,11,12,13,14, zijn bestaande schermen nog steeds beperkt in het aantal omstandigheden dat tegen de biosensor kan worden getest.Hier hebben we deze beperkingen overwonnen, de screening-inhoud en doorvoer in orde van grootte verhoogd, door druppelmicrofluïdica en geautomatiseerde twee-foton fluorescentie-levensduurbeeldvorming (2p-FLIM) te combineren.Fluorescentie-levensduur is de gemiddelde tijd tussen fotonenabsorptie en fotonenemissie, en levensduursensoren zijn naar voren gekomen als krachtige hulpmiddelen voor het kwantificeren van kleine molecuulniveaus in intacte cellen7,15,16.Hier hebben we gebruik gemaakt van microfluïdisch geproduceerde semi-permeabele gels, genaamd gel-shell beads (GSB's)17 die dienen als microschaal dialysekamers en hebben ze gebruikt om duizenden onafhankelijk geïsoleerde levenslange sensorvarianten te testen tegen veel verschillende omstandigheden, waarbij tegelijkertijd affiniteit, specificiteit en respons werden geëvalueerd. maat.We laten ook zien hoe ons screeningsysteem, BeadScan, kan worden gebruikt om snel genetisch gecodeerde fluorescerende biosensoren te ontwikkelen en te optimaliseren.Als demonstratie van de mogelijkheden van ons scherm hebben we BeadScan gebruikt om een ​​hoogwaardige levenslange sensor voor lactaat te genereren, genaamd LiLac.Lactaat is een belangrijk product van glycolyse dat recentelijk is gewaardeerd als een belangrijke cellulaire brandstof die in het bloed circuleert, een middel om de redoxtoestand over cellen en weefsels te communiceren, en een voorkeursbrandstof voor bepaalde soorten kanker18,19,20.Bestaande lactaatbiosensoren zijn gebruikt om het metabolisme in de hersenen en in kankercellen te onderzoeken21,22,23,24,25,26, maar elk heeft beperkingen die kwantificering uitdagend maken (bijv. zwakke gevoeligheid voor fysiologische veranderingen in lactaat, of ongewenste reacties op calcium). en/of pH).LiLac vertoont een grote responsgrootte (1,2 ns levenslange verandering en een > 40% intensiteitsverandering in zoogdiercellen), specificiteit voor fysiologische [lactaat] en resistentie tegen calcium of veranderingen in pH.Bovendien is de levenslange respons van LiLac zeer nauwkeurig en vereist geen normalisatie, wat de kwantificering van lactaatconcentraties in levende cellen vergemakkelijkt.LiLac vormt dus een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van het metabolisme op eencellig niveau en demonstreert de voordelen van onze screeningsaanpak.GSB's zijn ideale microvaten voor het testen van biosensoren onder een reeks zeer uiteenlopende omstandigheden, zoals voor een dosis-responscurve of specificiteitstest.Hun semipermeabele omhulsels wisselen opgeloste stoffen uit onder 2 kDa17, waardoor ze DNA en biosensor-eiwit kunnen behouden terwijl ze kleine moleculen passeren, zoals de doelanalyten van chemosensoren.We ontdekten dat GSB's van nature aan schone glazen dekglaasjes kleven, vermoedelijk vanwege hechting tussen blootgestelde positieve ladingen in de "schaal" en de negatieve lading op glas.Door GSB's af te beelden die voorgezuiverd biosensor-eiwit bevatten, kan biosensorfluorescentie worden gemeten onder een reeks omstandigheden door oplossingen rond de hechtende GSB's uit te wisselen (Fig. 1a-d).Dit testformaat is handiger voor het testen van een diverse reeks omstandigheden dan testplaten met meerdere putjes of microcapillairen.We kunnen deze benadering gebruiken om biosensorreacties op analyten zoals ATP of NADH te meten, wat aantoont dat de polyelektrolytschillen van de GSB's zelfs deze middelgrote biomoleculen met meerdere ladingen doorlaten.een cartoonafbeelding van een GSB met plasmide-DNA en fluorescerend biosensor-eiwit.Een agarosegelkern is gewikkeld in een polyelektrolytschil met een gerapporteerde molecuulgewichtgrens van ~ 2 kDa17.b Een enkele GSB van 20 m gedoteerd met een groene fluorescerende biosensor, helderveld (links) en epifluorescentie (rechts), schaalbalk van 5 m.c Dosisresponscurve van Peredox, een fluorescentielevensduursensor die reageert op NAD+/NADH1,47, verkregen bij pH 7,3 bij 34 °C op gezuiverd biosensoreiwit ingekapseld in GSB's (gemiddelde ± SD).Gezuiverd lactaatdehydrogenase (LDH) plus lactaat en pyruvaat werd gebruikt om de NAD+/NADH-verhouding buiten de GSB's in te stellen, volgens methoden die eerder waren vastgesteld voor Peredox47.LDH komt niet in de GSB's.d Filmstrip van de fluorescentie-levensduurafbeeldingen die zijn gebruikt om de gegevens in (c) te genereren, pseudogekleurd volgens de levenslange heatmap aan de rechterkant en gerangschikt in volgorde van lactaat/pyruvaat (L/P).30 m schaalbalk.e BeadScan overzichtsschema.Enkele plasmiden uit een biosensorbibliotheek worden geïsoleerd in microfluïdische druppeltjes die dienen als reactiekamers ter grootte van een picoliter voor op PCR gebaseerde amplificatie.Klonale amplicons worden geïmmobiliseerd op affiniteitskralen die in elke druppel worden ingebracht, wat uiteindelijk een bibliotheek van klonale DNA-kralen oplevert.Enkele kralen worden vervolgens opnieuw ingekapseld in nieuwe druppeltjes die in vitro transcriptie/translatie (IVTT) reagentia bevatten voor biosensorexpressie.IVTT-druppeltjes die een rijpe biosensor bevatten, worden vervolgens omgezet in semipermeabele gel-shell beads (GSB's).Tot 10.000 GSB's zijn gerangschikt op een glazen dekglaasje voor geautomatiseerde fluorescentiebeeldvorming en -analyse.Enkele GSB's die gunstige biosensor-eigenschappen vertonen, worden verzameld via een micropipet en de genotypen worden teruggewonnen uit de DNA-kraal door PCR en Sanger-sequencing.Het gebruik van GSB's voor een scherm van veel biosensorvarianten vereist het vangen van een enkele soort DNA en het afgeleide biosensor-eiwit in individuele GSB's, met een voldoende hoge concentratie biosensor-eiwit om de fluorescentie te testen (meestal in het micromolaire bereik voor fluorescerende eiwitten).Eerder zijn GSB's gebruikt voor de selectie van geëvolueerde enzymen door individuele bacteriën die enzymvarianten tot expressie brengen te vangen en te lyseren .De enzymen bevinden zich op nanomolaire niveaus in de GSB's en hun activiteit wordt gevisualiseerd met fluorogene substraten;maar zonder het voordeel van enzymatische amplificatie in de test, zijn fluorescerende biosensoren moeilijk te detecteren bij deze lage concentraties.Om dit probleem te overwinnen, hebben we een geoptimaliseerde strategie ontwikkeld voor micromolaire expressie van enkele biosensorvarianten in individuele GSB-compartimenten (Fig. 1e), met behulp van microbead-geïmmobiliseerd DNA om expressie aan te sturen in een in vitro gekoppeld transcriptie / translatie (IVTT) -systeem (Suppl. Figuur 1).Eerst worden individuele DNA-moleculen uit een bibliotheek van varianten geïsoleerd in druppeltjes en geamplificeerd door PCR.Vervolgens wordt elke geamplificeerde klonale pool van DNA gevangen op polystyreen microbolletjes via een biotine-streptavidine koppeling.Deze klonale DNA-kralen worden vervolgens gebruikt om individuele IVTT-reacties in druppeltjes aan te sturen, die vervolgens worden omgezet in GSB's.Deze reeks stappen wordt bereikt door sequentieel gebruik van microfluïdische water-in-olie druppelvorming en druppelelektrofusiestappen (Fig. 2) en levert GSB's op met ~ 1000-voudig hogere eiwitexpressieniveaus dan de eerder gepubliceerde methode.Conversie van een biosensor-DNA-bibliotheek in ~ 105 GSB's kan in 2 dagen worden gedaan en ~ 10.000 varianten kunnen mogelijk binnen een week worden gescreend.een verdund bibliotheek-DNA wordt gemengd met hot-start PCR-reagentia en geëmulgeerd met behulp van een microfluïdische druppelgenerator, zodat de meeste druppeltjes 1 of 0 kopieën van DNA bevatten.Alle druppeltjes hebben 5'-TexasRed-Forward (plak met roze stip) en 5'-Biotin-Reverse (plak met open dubbele vijfhoek) primers, zodat amplicons een TexasRed-tag op de sense-streng en een biotine-tag op de antisense-streng dragen .Druppels met geamplificeerd DNA zullen kleuren met SYBR Green, toegevoegd aan een diagnostisch aliquot van de emulsie.b Gebiotinyleerd DNA wordt gevangen op streptavidinekorrels door gecontroleerde microfluïdische samenvoeging van PCR-druppeltjes met parelbevattende druppeltjes.PCR-druppeltjes worden opnieuw in een microfluïdisch apparaat geïnjecteerd, terwijl een suspensie van streptavidineparels op de chip wordt geëmulgeerd.Paren druppeltjes worden actief samengevoegd (>80% efficiëntie) als ze een gelokaliseerd veld passeren dat wordt gegenereerd door een elektrode (10 kHz, 0,5 kV), op welk punt het geamplificeerde DNA wordt opgevangen door de kralen.c Toevoeging van perfluoroctanol (PFO) breekt de emulsie, die zich scheidt in een waterige fase die de korrels bevat en een oliefase.De kralen worden vervolgens gewassen om achtergebleven ongebonden DNA te verwijderen.d De bibliotheek met DNA-korrels wordt opnieuw ingekapseld in nieuwe druppeltjes samen met in vitro transcriptie/translatie (IVTT) reagentia met behulp van een aangepast microfluïdisch apparaat dat de twee waterige stromen onmiddellijk voorafgaand aan emulgering combineert, waardoor vroegtijdige transcriptie en mRNA-kruisbesmetting worden verminderd.Alleen druppeltjes die een DNA-kraal bevatten, zullen fluorescerend biosensor-eiwit tot expressie brengen na een nachtelijke incubatie bij 30 ° C.e Ten slotte worden IVTT-druppeltjes omgezet in duurzame semipermeabele GSB's door gecontroleerde microfluïdische samenvoeging met een mengsel van agarose (gel in sol) en alginaat (polyanion), gevolgd door emulsiebreuk door PFO in aanwezigheid van PAK (polykation).De twee polyelektrolyten vormen een semipermeabele schil aan het oppervlak van de gelsteiger, waardoor eiwitten en DNA in de gel worden gevangen, maar kleine moleculen (<2 kDa) erdoorheen kunnen gaan17.Continue uitwisseling van liganden zorgt voor het verzamelen van volledige dosis-responscurven van het biosensor-eiwit dat in elke gel is ingekapseld tijdens downstream screening.Schaalbalken vertegenwoordigen 20 m.De eerste stap in de workflow is het voorbereiden van de klonale DNA-bibliotheek, met een voldoende aantal kopieën om hoge expressie van biosensor-eiwit in IVTT-druppeltjes (104-105 kopieën/druppel) te stimuleren.Om hoge kopieaantallen van individuele klonen te bereiken, worden enkele kopieën van DNA geïsoleerd in microfluïdische druppeltjes en geamplificeerd door PCR (emulsie-PCR of emPCR; Fig. 2a).Het emulgeren van een mengsel van zeer verdund DNA zorgt ervoor dat de meeste druppeltjes 1 of 0 kopieën van DNA hebben.Elke emPCR-druppel dient dan als een reactiekamer op microschaal voor amplificatie van de geïsoleerde sjabloon met behulp van PCR-reagentia.Hoewel we het uiteindelijke aantal kopieën/druppels niet hebben gekwantificeerd, kan een emPCR-druppel van 35 m theoretisch miljoenen kopieën van ~ 2 kb dsDNA produceren voordat de reagentia zijn uitgeput.Omdat gezuiverde IVTT-systemen zeer gevoelig zijn voor veranderingen in de reactieomstandigheden, met name reagensverdunning, resulteert het direct combineren van emPCR-druppeltjes met IVTT-druppeltjes van vergelijkbare grootte in een slechte sensorexpressie.Daarom hebben we ervoor gekozen om het geamplificeerde DNA op kralen te immobiliseren, de DNA-kralen te zuiveren en vervolgens een minimaal volume te gebruiken om ze in IVTT-druppeltjes af te leveren, zodat de uiteindelijke IVTT + DNA-kraaldruppeltjes onverdunde IVTT-reagentia bevatten zonder overdracht van PCR-reagentia.Bestaande werkwijzen voor het produceren van DNA-parels binden eerst primers aan parels en amplificeren vervolgens vanaf het pareloppervlak.Deze methoden zijn beperkt tot ~ 103 kopieën / kraal voor grote amplicons (~ 1-2 kb voor een biosensor), vermoedelijk vanwege de lage efficiëntie van amplificatie vanaf een vast oppervlak .In onze handen slaagden deze methoden er niet in om op betrouwbare wijze kralen te produceren die waren geladen met een hoog aantal kopieën van amplicons van volledige lengte;slechts 0,1-1% van de resulterende DNA-korrels was in staat om onze doelsensoren in IVTT-druppeltjes sterk tot expressie te brengen.Om deze beperkingen te overwinnen, lieten we in plaats daarvan template-DNA vrij in oplossing amplificeren in druppeltjes die een gebiotinyleerde 3'-primer bevatten, en vervolgens de PCR-producten op streptavidine-parels geïmmobiliseerd.Om dit te bereiken, wordt elke geamplificeerde emPCR-druppel gefuseerd met een gepaarde druppel die een streptavidine-affiniteitskraal bevat (figuur 2b) via gecontroleerde actieve microfluïdische samenvoeging met een snelheid van ~ 4-5 miljoen druppeltjes per uur.De streptavidine-kraal vangt het geamplificeerde gebiotinyleerde DNA op, zodat elke korrel wordt gecoat in vele kopieën van een enkele kloon.De kralen worden vervolgens uit de druppeltjes losgelaten en overtollig DNA wordt weggewassen (figuur 2c).Met behulp van deze methode kan een polystyreenkraal van 6 m> 200.000 klonale kopieën van> 2 kb-amplicons vastleggen en kunnen miljoenen kralen parallel worden bereid.Optimale expressie van oplosbaar sensoreiwit werd echter bereikt met kralen die opzettelijk beperkt waren tot ~ 100.000 kopieën van DNA door een subset van streptavidine-bindingsplaatsen vooraf te blokkeren, omdat dichter beladen kralen soms leidden tot de accumulatie van zichtbare eiwitaggregaten in de druppel (Suppl Afb. 1c).We hebben ook de concentratie van gebiotinyleerde 3'-primer in de emPCR-druppeltjes geoptimaliseerd.We ontdekten dat het gebruik van een overmaat aan gebiotinyleerde 3'-primer tot slechte resultaten leidde, vermoedelijk omdat de niet-verlengde originele gebiotinyleerde 3'-primer concurreert met volledig uitgebreid gebiotinyleerd DNA voor streptavidine-bindingsplaatsen.Daarom hebben we een beperkende concentratie van de 3'-primer gebruikt om de volledige verlenging van alle gebiotinyleerde primermoleculen te garanderen, zodat alleen volledig verlengde amplicons op de streptavidine-parels worden gevangen.Om de biosensorbibliotheek tot expressie te brengen, worden enkele DNA-kralen gezuiverd en opnieuw ingekapseld in druppeltjes die IVTT-reagentia bevatten met behulp van een tweestrooms co-flow druppelgeneratorapparaat dat korrels in de IVTT-stroom introduceert onmiddellijk voorafgaand aan druppelinkapseling (Fig. 2d, Suppl. Afb. 2a–b).Na het testen van meerdere celvrije expressiesystemen, waaronder cellysaten, bereikten we optimale biosensor-expressieniveaus met gezuiverde IVTT-reagentia, met name het PUREfrex2.0-systeem (suppl. Fig. 1).Zodra het biosensor-eiwit tot expressie is gebracht, worden IVTT-druppeltjes omgezet in GSB's door: 1) enkele IVTT-druppeltjes samen te voegen met druppeltjes die een mengsel van agarose (gel) en alginaat (polyanion) bevatten, 2) de druppeltjes te dispergeren in een polykation-emulsie (poly( allylamine)hydrochloride, PAH; figuur 2e, suppl. figuur 2c-d), en vervolgens 3) het breken van de gemengde emulsie om complexering van de twee tegengesteld geladen polymeren mogelijk te maken.Een semi-permeabele schil vormt zich aan het oppervlak van de agarosegelmatrix, waardoor het biosensor-eiwit erin wordt gevangen, maar kleine moleculen erdoorheen kunnen .In de eerste tests hebben we tijdens de laatste stap een verlies van ~ 50-60% aan sensoreiwit waargenomen.Hoewel de snelheid van schilvorming onbepaald is, nemen we aan dat bij verstoring van de emulsie een deel van het eiwit uit de gel diffundeert voordat de schil zich kan vormen.Daarom hebben we Ni-NTA-nanosferen in de gels opgenomen om het his6-gelabelde sensoreiwit te behouden tijdens afzetting van de schaal.Zodra de schaal rond de rijpe GSB is gevormd, wordt sensoreiwit met milde EDTA-behandeling uit de nanosferen vrijgemaakt.Deze wijziging verbeterde de retentie van sensoreiwitten van IVTT-druppeltjes om GSB's te rijpen tot ~ 90-100%.In zijn uiteindelijke vorm dient elke GSB als een dialysekamer op microschaal met een unieke biosensorvariant.De geïmmobiliseerde GSB's (~ 105 GSB's op een 1 cm2 glazen dekglaasje) zijn bestand tegen >20 mL/min stroomsnelheden binnen een standaard microscopie-perfusiekamer, waardoor een snelle uitwisseling van externe omstandigheden mogelijk is, terwijl fluorescentiereacties van de ingekapselde biosensoren worden geregistreerd met behulp van 2p-FLIM.Na screening worden enkele GSB's teruggewonnen met een microcapillair en worden DNA-sequenties teruggewonnen door PCR-amplificatie en Sanger-sequencing (suppl. Fig. 3).Omdat dit systeem gel-shell-kralen gebruikt om biosensorbibliotheken snel te scannen op geoptimaliseerde eigenschappen, hebben we het BeadScan genoemd.Hoewel BeadScan kan worden gebruikt om veranderingen in fluorescentie-intensiteit of levensduur te volgen, vinden we dat levensduurmetingen robuuster zijn tegen de cumulatieve effecten van fotobleken en nauwkeurige dosisresponsen opleveren van enkele GSB's.Om de mogelijkheden van ons systeem te demonstreren, wilden we een de novo genetisch gecodeerde biosensor voor lactaat genereren.Een bestaande FRET-biosensor voor lactaat, Laconic, is gebruikt om neuronaal metabolisme te onderzoeken1,21,29,30, maar de oppervlakkige respons op lactaat en optische complicaties die voortkomen uit het gebruik van twee fluoroforen maken kwantitatief gebruik uitdagend.Nieuwere enkele fluorofoor biosensoren, GEM-IL, Green Lindoblum, CanlonicSF en eLACCO1.1 hebben ook beperkingen23,24,25,26.GEM-IL reageert op fysiologische pH-veranderingen, wat nauwkeurige lactaatmetingen bemoeilijkt;Groene Lindoblum heeft een zeer hoge affiniteit voor lactaat buiten het fysiologische regime;en CanlonicSF en eLACCO1.1 reageren op zowel lactaat als calcium, waardoor hun bruikbaarheid wordt beperkt tot compartimenten met verzadigende niveaus van calcium.CanlonicSF en eLACCO1.1 zijn gebaseerd op het TTHA0766 periplasmatisch lactaat- en calciumbindend eiwit van T. thermophilus, terwijl alle andere bestaande lactaatbiosensoren de LldR-transcriptiefactor van E. coli en C. glutamicum gebruiken.Gezien het beperkte succes bij het verbeteren van op LldR gebaseerde biosensoren en de calciumgevoeligheid van op TTHA0766 gebaseerde biosensoren, hebben we een niet-geteste scaffold voor onze biosensor geselecteerd: het extracellulaire dCACHE-domein van het bacteriële chemotaxis-eiwit, TlpC van H. pylori.TlpC is zeer specifiek voor lactaat en vertoont geen detecteerbare affiniteit voor structureel vergelijkbare liganden zoals pyruvaat of oxaalacetaat31.Hoewel alleen de ligand-gebonden kristalstructuur van het TlpC-lactaatbindingsdomein is opgelost, redeneerden we dat lactaatbinding een grote conformationele verandering kan veroorzaken tussen de N- en C-termini, die zich dicht bij elkaar bevinden .Inderdaad, de structureel vergelijkbare chemotaxis-receptor, TlpA, kan grote structurele verschuivingen tot 8 A opvangen tussen de N-terminale stengelhelix en de C-terminale β-streng die verbinding maakt met transmembraandomeinen .Om deze beweging te benutten, waren de N- en C-termini van TlpC verbonden met het groen fluorescerende eiwit T-Sapphire (Fig. 3a), wat een verandering in de fluorescentielevensduur heeft opgeleverd in verschillende eerdere eenkleurige biosensoren .een schema van het ontwerp van de lactaatbiosensor.Het lactaatbindende domein van het TlpC-eiwit werd ingevoegd in het fluorescerende eiwit, T-Sapphire.De flexibele linkergebieden (gele sterren) die de twee domeinen verbinden, werden gevarieerd in een grote biosensorbibliotheek, waarbij 49.152 biosensorvarianten werden bemonsterd.b ~ 10.000 GSB's die de TlpC-TS-lactaatbiosensorbibliotheek bevatten, werden geïmmobiliseerd op een glazen dekglaasje van 1 cm2 in een perfusiekamer.2196 GSB's voldeden aan de minimale fluorescentiedrempel voor ROI-detectie.Het samengevoegde beeld wordt opnieuw gemaakt van 121 afzonderlijke frames die zijn opgenomen met 2p-FLIM.De witte doos markeert een enkel frame (771 m vierkant).c Eén frame met een enkele GSB (pijl) met een biosensorvariant die goed reageerde op lactaat.De biosensor vertoonde een hoge fluorescentielevensduur bij laag [lactaat] en een lage levensduur bij hoog [lactaat].Levenslange waarden zijn pseudogekleurd volgens de heatmap onderaan.Schaalbalken geven 100 m aan.d Eerste scherm van de TlpC-TS-lactaatbiosensorbibliotheek, met gegevens van individuele biosensorvarianten vastgelegd in GSB's.Gemiddelde fotonentellingen binnen elke ROI worden uitgezet tegen de maximale verandering in levensduur tussen 0 en 10 mM lactaat;elk datapunt vertegenwoordigt een enkele GSB.Er werden twee GSB's met grote veranderingen in de levensduur geselecteerd (gestippelde vakken).e Dosis-responscurves van elk van de twee individuele GSB's aangegeven in (d).f Prestaties van TlpC-TS #1059 bij vier verschillende pH-waarden.Dosis-responscurven werden verzameld op een uniform monster van GSB's die TlpC-TS #1059 tot expressie brachten (n = 96 GSB's, gemiddelde ± SD).g Multiparameterscreening van een linkerbibliotheek van TlpC-TQ, waarbij levenslange veranderingen in reactie op lactaat versus pH voor elk van 1411 individuele GSB's worden vergeleken.Ondanks een algemene correlatie tussen lactaat- en pH-geïnduceerde reacties, konden zeldzame varianten die weerstand boden aan deze trend worden geïsoleerd (#1083).h Lactaatdosis-responsen van elk van de twee individuele GSB's aangegeven in (g) bij pH 6,7 en pH 7,5.De pH-resistente variant (#1083, boven) werd omgedoopt tot LiLac.i LiLac-reacties op lactaat zijn zeer goed bestand tegen veranderingen in fysiologische pH.Gegevens verzameld bij kamertemperatuur met behulp van een uniform monster van GSB's die LiLac uitdrukken (n = 90 GSB's, gemiddelde ± SD).In (f, i) worden enkele foutbalken afgesloten door de gegevenspunten.Omdat de linkers die het fluorescerende eiwit en de scaffold verbinden de biosensorrespons diepgaand kunnen beïnvloeden, hebben we een bibliotheek van TlpC-TS-biosensorvarianten gegenereerd die 49.152 verschillende linkers hebben bemonsterd, variërend in lengte en samenstelling (Fig. 3a), en deze bibliotheek gescreend met BeadScan (Fig. 3b-c).We hebben twee biosensoren met hoog contrast geïsoleerd, TlpC-TS #1537 en #1059, die een omgekeerde levensduurverandering vertonen (|ΔLT | = respectievelijk 0,2 ns en 0,3 ns) met schijnbare affiniteiten (Kapp = 0,19 ± 0,13 mM en 0,66 ± 0,11 mM respectievelijk Fig. 3d-e) binnen het fysiologische bereik van lactaat, dat circuleert bij 1-2 mM18,20,34.Intracellulaire lactaatconcentraties variëren sterk tussen celtypen en fysiologische toestanden, maar worden doorgaans verwacht binnen 0, 5-5 mM te zijn.Bij verdere in vitro karakterisering ontdekten we dat TlpC-TS zeer specifiek was voor zijn verwante ligand ten opzichte van andere chemisch vergelijkbare liganden, maar ook gevoelig was voor pH-veranderingen binnen fysiologisch relevante bereiken (figuur 3f).Veel enkele fluorofoor biosensoren reageren op pH, inclusief alle bovengenoemde lactaat biosensoren, behalve CanlonicSF (die reageert op calcium).Omdat de pH niet constant is in levende cellen37, vereisen gegevens van pH-responsieve biosensoren een zorgvuldige interpretatie;en hoewel het populair is om pH-responsen te kalibreren met een nulbiosensor, vertonen de bezette en onbezette biosensor vaak verschillende gevoeligheden38,39,40,41,42,43,44,45, waardoor dit een onvolmaakte aanpassing is.Daarom wilden we de pH-responsen van onze prototype lactaatbiosensor verminderen om een ​​nauwkeurigere kwantificering van intracellulaire lactaatconcentraties mogelijk te maken.We redeneerden dat de pH-respons zou kunnen voortkomen uit het T-Sapphire-fluorescerende eiwit46, en we herhaalden onze linkerbibliotheek met behulp van mTurquoise2, een zeer pH-resistente fluorofoor die onlangs is gebruikt om een ​​fluorescerende levenslange sensor voor calciumniveaus te ontwikkelen7, die ook helderder en meer fotostabiel is dan T-Sapphire7,14,46.Met behulp van BeadScan hebben we de nieuwe bibliotheek (hierin TlpC-TQ genoemd) gescreend op verbeterde lactaatreacties met verminderde pH-gevoeligheid (Fig. 3g-h).Voor de meeste TlpC-TQ-biosensorvarianten was de grootte van de lactaatrespons gecorreleerd met die van de pH-respons (figuur 3g).Eén variant in het bijzonder, TlpC-TQ #1297, had dezelfde reactie op een verandering in pH (7,5 tot 6,7) als op de toevoeging van 0,1 mM lactaat (Fig. 3H).Desalniettemin hebben we uit 1.411 varianten met succes een zeldzame variant geïsoleerd, TlpC-TQ #1083, die grote lactaatresponsen en sterk verminderde pH-gevoeligheid vertoonde (Fig. 3h-i; Suppl. Fig. 4).Het vertoonde ook een groter dynamisch bereik met een hoge gevoeligheid voor fysiologische lactaatniveaus (Kapp = 0,62 ± 0,04 mM bij pH 7,3 bij 24 ° C), kenmerken die werden medegeselecteerd met behulp van onze screeningmodaliteit.We noemden deze geoptimaliseerde levenslange lactaatbiosensor LiLac (DNA- en eiwitsequenties in Suppl. Note 1).We karakteriseerden de fotofysische parameters (Suppl. Fig. 5, Suppl. Table 1) en de prestaties van LiLac met betrekking tot specificiteit en temperatuur in verschillende contexten, te beginnen met een uniform monster van IVTT-geproduceerde LiLac in GSB's.LiLac is zeer specifiek voor lactaat ten opzichte van andere chemisch vergelijkbare liganden, waaronder pyruvaat, evenals calcium (figuur 4a).De totale levensduurexcursie van ~0,8 ns is vergelijkbaar met die van andere hoogwaardige levensduursensoren, waaronder Tq-Ca-FLITS en Peredox (respectievelijk ~ 1,3 ns en ~0,8 ns; Fig. 4b)7,47.Bij hogere temperaturen neemt het dynamische bereik toe (~ 1 ns bij 34 ° C) terwijl de affiniteit van de biosensor voor lactaat afneemt (Kapp = 2,68 ± 0,15 mM bij pH 7,3 bij 34 ° C; Fig. 4c).a Specificiteitstests tonen aan dat LiLac alleen een verandering in levensduur vertoont bij blootstelling aan lactaat.Een uniform monster van GSB's die LiLac tot expressie brengen, werd blootgesteld aan 10 mM of 1 mM lactaat, of 1 mM van elk van de negen andere chemische verbindingen die kunnen interfereren met lactaatbiosensoren (n = 19 GSB's, foutbalken zijn gemiddelde ± SD).|ΔLT |(ns) geeft de grootte van de verandering in de levensduur aan ten opzichte van de buffer.b Een uniform monster van GSB's die LiLac tot expressie brengen, werd blootgesteld aan verschillende lactaatconcentraties bij pH 7,3 bij kamertemperatuur (RT, n = 90 GSB's) of bij c 34 ± 1 ° C (n = 21 GSB's, gemiddelde ± SD uitgezet).d Biosensorkalibratie uitgevoerd in permeabel gemaakte HEK293T-cellen bij 34 ± 1 °C.Cellen werden gepermeabiliseerd met β-escine in aanwezigheid van de lactaatdehydrogenaseremmer GSK-2837808A (2 M), vervolgens afgebeeld na blootstelling aan verschillende concentraties lactaat (4-12 cellen per gegevenspunt, gemiddelde ± SD).Inzetstukken van levenslange afbeeldingen van cellen in 0 en 100 mM lactaat tonen volledig gepermeabiliseerde (gezwollen) cellen.Pseudokleuring weerspiegelt empirische levensduurwaarden volgens de heatmap.Schaalbalken vertegenwoordigen 20 m.e Tijdsopgeloste aankomsthistogrammen van één foton voor LiLac uitgedrukt in permeabiliseerde HEK293T-cellen van (d), in aanwezigheid (grijze stippen) en afwezigheid (zwarte stippen) van lactaat, elk gebaseerd op een afbeelding van een enkele cel gemiddeld over 10 frames .Geschikte parameters voor 0 mM lactaat waren A1 = 0,31, τ1 = 2,47 ns, A2 = 0,69, τ2 = 3,81 ns, Gaussiaans σ = 0,078 ns en χ2 = 1,09;en voor 100 mM lactaat waren ze A1 = 0,56, τ1 = 0,93 ns, A2 = 0,44, τ2 = 2,3 ns, Gaussiaans σ = 0,078 ns en χ2 = 1,11.We hebben onze karakterisering van LiLac uitgebreid tot zoogdiercellen, omdat de eigenschappen van biosensoren enigszins kunnen afwijken tussen in vitro en in-cel kalibraties10,40,48.LiLac was helder en kwam goed tot expressie in het cytosol van zoogdiercellen.Gepermeabiliseerde HEK293T-cellen die LiLac tot expressie brengen, vertoonden levenslange waarden tussen 3, 0 en 1, 8 ns als reactie op veranderingen in geperfundeerd lactaat variërend van 0-100 mM, met een Kapp van 2,66 ± 0,18 mM gemeten bij 34 ° C (Fig. 4d-e).De grote respons en hoge helderheid van de LiLac-biosensor leidden tot zeer robuuste signalen in zoogdiercellen, waarbij de levensduurmetingen van individuele cellen onderworpen aan veranderingen in lactaat superponeerbaar waren (Fig. 5a-b).In vergelijking met de kalibratiecurve verkregen uit gepermeabiliseerde cellen, vertoonden intacte cellen een iets langere levensduur, wat duidt op lagere lactaatniveaus in cellen ten opzichte van de externe toestand, en mogelijk een weerspiegeling is van verschillen in lactaatinvoer door de transporter naarmate extern [lactaat] toeneemt35,36,49 .een filmstrip met levenslange afbeeldingen die intacte HEK293T-cellen tonen die LiLac tot expressie brengen bij 34 ± 1 ° C.Levensduurwaarden zijn zeer uniform over een populatie van cellen die aan een enkele lactaatconcentratie zijn blootgesteld en reageren op veranderingen in lactaatconcentratie in de externe badoplossing ([Lac]ex).Cellen werden voorafgaand aan beeldvorming geïncubeerd in 0 lactaat/0 glucose.20 m schaalbalk.b Overlappende levensduursporen van elk van de 15 cellen waargenomen in (A) tonen aan dat LiLac zeer reproduceerbare metingen van intracellulaire lactaatconcentraties over een celpopulatie oplevert en gevoelig is voor zelfs bescheiden manipulaties van extracellulair lactaat (1 tot 2 mM).Metingen geregistreerd om de 15 s.c Filmstrip en d eencellige sporen van hippocampale neuronen in acute plak die LiLac tot expressie brengen.Plakjes in 10 mM glucose werden blootgesteld aan 0, 2 of 10 mM lactaat, waarna zowel lactaat als glucose werden uitgewassen.Metingen geregistreerd om de 30 s.Schaalbalk van 15 m.Afbeeldingen zijn pseudogekleurd door empirische levensduurwaarden volgens de heatmap, en sporen geven de gemiddelde levensduur aan die is berekend over een aankomsttijd van 8 ns (τ8).We vergeleken de prestaties van LiLac met die van de bestaande, levenslang compatibele lactaatbiosensor Laconic.Hoewel de Laconic-output over het algemeen wordt geïnterpreteerd als een FRET-ratio, produceert de donorsoort ook een meetbare verandering in levensduur, zoals typisch is voor FRET-biosensoren.In cellen vertoont LiLac een ~ 6-voudig grotere responsgrootte,> 5-voudig verminderde variabiliteit en aanzienlijk hogere signaal-ruisverhouding (LiLacSNR ~ 25, Laconicdonor-levensduur, SNR <1; suppl. Fig. 6a-c).Hier schat de SNR-metriek de verandering in het levenslange signaal in cellen van 0 tot 10 mM extern lactaat ten opzichte van het gemiddelde geluidsniveau bij elke omstandigheid.We hebben ook waargenomen dat de levensduur van de Laconic-donorsoort sterk varieert tussen cellen die baden in lactaat (suppl. Fig. 6b-c), zoals ook waargenomen met zijn FRET-signaal .Ter vergelijking: de hoge precisie van de LiLac-uitlezing suggereert dat de cel-tot-cel variabiliteit die wordt waargenomen met Laconic een artefact van de biosensor kan zijn.Hoewel de bron van deze variabiliteit onbepaald is, suggereert recent bewijs dat Laconic gedeeltelijk kan worden afgebroken in cellen, waardoor een fluorescentiesignaal wordt geproduceerd dat losgekoppeld is van lactaatbinding .Voortbouwend op de sterke prestaties van LiLac in gekweekte cellen, onderzochten we vervolgens de prestaties ervan in acute hippocampale hersenplakjes (Fig. 5c-d).LiLac kwam goed tot expressie in neuronen en reageerde zeer goed op badtoepassing van verschillende concentraties lactaat, en vertoonde een strakke verdeling van levenslange waarden over neuronen, zoals werd waargenomen bij de prestaties in gekweekte cellen.Levenslange waarden in de eindconditie van 0 mM lactaat/0 mM glucose waren ~0,1 ns hoger dan in de beginconditie van 0 mM lactaat/10 mM glucose, wat aantoont dat LiLac verstoringen in baseline [lactaat] in ex vivo preparaten kan rapporteren.1:Cel Metab.CAS PubMed-artikel Google ScholarCAS PubMed-artikel Google ScholarCAS PubMed PubMed Centraal artikel Google ScholarPubMed PubMed Centraal artikel Google ScholarCAS PubMed PubMed Centraal artikel Google ScholarCAS PubMed PubMed Centraal artikel Google ScholarPubMed PubMed Centraal artikel Google ScholarCAS PubMed-artikel Google ScholarCel Metab.CAS PubMed PubMed Centraal artikel Google ScholarCAS PubMed PubMed Centraal artikel Google ScholarCAS PubMed-artikel Google ScholarCAS PubMed PubMed Centraal artikel Google ScholarCAS PubMed PubMed Centraal artikel Google ScholarCAS PubMed PubMed Centraal artikel Google ScholarPubMed PubMed Centraal artikel Google ScholarCAS PubMed-artikel Google Scholardes.CAS PubMed PubMed Centraal artikel Google ScholarCel Metab.CAS PubMed-artikel Google ScholarCAS PubMed-artikel Google ScholarCAS PubMed PubMed Centraal artikel Google ScholarCAS PubMed-artikel Google ScholarCAS PubMed-artikel Google ScholarCAS PubMed PubMed Centraal artikel Google ScholarCAS PubMed-artikel Google ScholarCAS PubMed PubMed Centraal artikel Google ScholarCAS PubMed PubMed Centraal artikel Google ScholarPubMed PubMed Centraal artikel Google ScholarCAS PubMed PubMed Centraal artikel Google ScholarCAS PubMed PubMed Centraal artikel Google ScholarCAS PubMed-artikel Google ScholarCAS PubMed PubMed Centraal artikel Google ScholarCAS PubMed PubMed Centraal artikel Google ScholarCAS PubMed-artikel Google ScholarCAS PubMed-artikel Google ScholarFys.Fys.PubMed PubMed Centraal artikel Google Scholar